pcr实验步骤:逆转录PCR的实验步骤用到哪些试剂和仪器

逆转录PCR的实验步骤用到哪些试剂和仪器

1、移液器：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：放置1ml吸头的一个，1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：1个13、大瓷缸：稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：

荧光定量PCR的操作步骤

荧光定量PCR　实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，手动剧烈振荡管体15秒后，离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：RNA溶于40 μl DEPC水中，剩余样品RNA为35 μl，35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆转录酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合，②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致。dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 阳性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，共40个循环。①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号 反应物 剂量 1 10×PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，35个PCR循环（94℃1分钟；72℃延伸5分钟。②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。③将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下：

什么是PCR实验室？

PCR实验室又称为基因扩增实验室，利用分子生物学技术，也可以看做是生物体外的特殊DNA复制。利用基因追踪系统，掌握人体内部的病毒含量，此种试验的精确度可达到纳米级别。PCR实验室对温度没有严格要求，从实验室人性化考虑，PCR实验室应通过各种措施，保证环境温度、湿度控制在一定范围之内。国内的二级医院基本上都在积极开展基因扩增检查实验室项目。

PCR实验室通风系统流程是什么

要达到目的做常规PCR，通过产物条带很容易看出。定量现在一般分为半定量PCR和real-time PCR（实时定量PCR）两种。半定量做法就是通过常规PCR，跑胶得到产物条带，然后通过软件对条带进行分析，将条带的强弱进行量化。

PCR实验测定

定性应该较容易理解，大体是有或无，强和弱，要达到目的做常规PCR，通过产物条带很容易看出。定量现在一般分为半定量PCR和real-time PCR（实时定量PCR）两种。半定量做法就是通过常规PCR，跑胶得到产物条带，然后通过软件对条带进行分析，将条带的强弱进行量化。real-time PCR定量更准确，它需要特定的仪器与试剂。原理是在PCR进行延伸的过程中其产物加上特定的荧光标记，然后通过机器读出荧光的强度来反应检测的样本中c-DNA的丰度。

PCR扩增实验中加样顺序是怎样的，为什么要按这种顺序加啊

PCR扩增实验中加样顺序如下：与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶。使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，在TaqDNA聚合酶的催化下，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。扩展资料模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，所以G-C含量较高的模板。

pcr的实验步骤是什么样子的？

双诚联盈净化工程技术——PCR实验步骤大致分三个步骤：一、组织的抽提：1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4. 冰上孵育5分钟5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管6. 加0.2 ml氯仿，000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9. 离心<000g 4℃ 5分钟 弃去上清液10. 加入1 ml 75%乙醇，震荡11. 离心<500g 4℃ 5分钟 弃去上清液12. 室温下使之变透明13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）14. 走RNA变性电泳观察18s，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：大约20分钟RNA 抽提物 5μlRadome 引物 2μlRNA sin 0.5μl1. 65℃ 15分钟2. 立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNA sin 0.5μl10mM dNTP 1μl5×RT 缓冲液 4μl25mM MgCl2 4μlAMV 逆转录酶 3μl1. 37℃ 1.5小时2. 94℃ 5-10分钟3. 反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：72℃ 2分钟 为第一个步1个循环2. 94℃ 45秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环3. 72℃ 10分钟4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时25mM MgCl2 3μl10×PCR 缓冲液 5μl10mM dNTP 1μl上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2CDNA模板 5μlddH2O 30μlTaq酶 1μl轻质石蜡油 50μl 100μl1. 94℃ 2分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环2. 94℃ 45秒。